安耐晒蓝盖子和金盖子区别是什么

最后用酶标仪分析结果：

颜色的深浅与样本中的支原体（ ）呈正相关。 用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值），根据标准曲线计算样品中支原体浓度。 整个过程时间比较短，一般三到四个小时就可以拿到结果。

整个过程除取样外，还包括标准稀释、加样、孵育、配液、洗涤、加酶、孵育、洗涤、显色、终止、结果分析。 步骤很多，很多步骤都需要一定的程序。 有经验的人只能保证准确性，所以技术要求比较高。

此外，由于对抗体特性的依赖，该方法可检测的支原体种类相对有限。 对于没有抗体的支原体，ELISA无能为力。

PCR方法

常规PCR方法：

根据支原体核糖体16s-23s rRNA特异保守序列设计引物，对待测样品DNA进行扩增，通过分析扩增产物大小进行判断。

以Venor®Gem支原体常规PCR检测试剂盒为例，简单介绍一下实验过程。

样品加工

类似于 qPCR

取适量待测样品上清液

95°C孵育10分钟

稳定样品

试剂制备

离心 ➡ 按比例混合 ➡ 静置 ➡ 混匀

PCR体系建立

设置阴性对照、阳性对照、双孔

盖上盖子并充分混合

启动 PCR 反应

按照说明设置程序

电泳结果分析

191bp为内参条带，说明PCR反应正常。

当样本中有支原体污染时，由于内参与支原体DNA的竞争，内参条带变弱（如支原体DNA>1000拷贝）。

在阳性对照中，支原体DNA>10,000拷贝，内控条带将完全消失。

80-90bp处可能存在引物自退火形成的条带，不影响检测结果。

如果待测样品抑制PCR，则内参对照条带变弱（与阴性对照相比），应先进行DNA提取（推荐：Venor® Gem Kit DNA Kit），再进行检测。

常规PCR的优点是检测时间短：2-3小时即可出结果，灵敏度高，特异性强，操作简单。

缺点也很明显。 当用PCR检测经过支原体灭活的样品时，由于支原体DNA仍然存在，此时PCR结果仍为阳性，说明样品已经感染了支原体。

另外，不同厂家的试剂盒差异较大，需要慎重选择。

ELISA法

至此，已经为大家介绍了几种常规的检测方法，我做了一个小总结，供大家参考。 有些单一的检测方法不够严谨，需要结合实验情况，采用多种方法进行检测，以保证结果的可信度。

培养法是金标准，但周期长，部分支原体检测不到；

染色方法通用，操作简单，但对支原体数量有要求，容易出现假阳性和假阴性；

ELISA法耗时长，但对操作人员要求比较高，需要获得相应的抗体才能进行检测；

常规PCR方法基本具备以上所有优点，但无法区分支原体的生死，所用试剂盒也有好有坏；

qPCR方法涵盖了上述所有优点，但对实验者有一定的经验要求，因此该方法也是目前非常常用的检测方法。

不同的是，在“一步到位”试剂盒中，内控直接加入到预混液中，使用起来更方便省时。

让我们详细介绍一下 ® 支原体检测试剂盒。

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指示

步

与经典方法非常相似：

样品处理 ➡试剂制备 ➡系统建立 ➡启动PCR反应 ➡结果判定

样品处理：

取约 100 μl 细胞上清液

95℃孵育后离心，取适量用于后续的qPCR。

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细胞培养样品往往富含 DNase，它也可以在低温下降解支原体 DNA。 因此，建议样品稳定。

试剂制备：

将缓冲液、预混液、阳性对照等试剂按说明书要求离心混合，处理后盖紧盖子。

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PCR体系建立：

在PCR管中，根据需要加入样品、阳性对照和新鲜培养基（阴性对照），并设置双孔，盖上盖子，摇匀。

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启动 PCR 反应：

根据需要的参数，设置好PCR仪，启动程序（具体参数请参考产品使用说明书或帝医生物官网，点击下方阅读原文即可）。

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